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实时捕获基因表达的早期步骤

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实时捕获基因表达的早期步骤

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在我们眼睛看不见的小鳞片上,生命的活动是通过蛋白质的制造而发生的,蛋白质赋予我们的细胞结构和功能。细胞蛋白质从DNA中编码的基因指令中获得行进顺序,DNA序列首先被复制并通过一个称为转录的多步骤过程形成RNA。

科罗拉多州立大学的一项研究合作专注于高分辨率荧光显微术和计算建模,以可视化和描述生命过程中的这些细节,在单个基因水平上实时精细地描述。现在,以博士后研究员琳达·弗雷罗·昆特罗为首的科学家们首次通过记录RNA聚合酶通过与DNA序列结合在何处、何时以及如何启动转录来观察早期RNA转录动力学。

突破性的技术,在日记本上详细说明自然通讯,有无数可能的分支;其中包括加深对基本生物学过程的理解,揭示某些疾病的遗传基础。

“这是第一次有人研究单拷贝基因中的RNA聚合酶磷酸化动力学,”Forero说,他是一名博士后研究员,由蒙福特教授兼生物化学副教授Tim Stasevich和化学与生物工程副教授Brian Munsky共同建议。在过去,这种早期的转录活动只能通过基因阵列来观察,基因阵列是由数百个基因拷贝组成的人工结构,在细胞核中并不常见。

斯塔塞维奇和蒙斯基领导了一次合作由凯克基金会资助以及国家普通医学科学研究所(通过两个最大化研究者的研究奖),该研究所正在寻求揭示和量化活体单细胞中的实时基因表达。弗雷罗在这两个实验室的合作下工作,他以前研究过与神经系统疾病相关的细胞膜中的蛋白质和转运体。


早期转录活性


如中所述自然通讯,Forero等人设计了一种方法,使用已建立的哺乳动物细胞系、工程荧光抗体片段和定制的超分辨率显微镜,以生动的颜色(蓝色、绿色和红色)捕捉早期转录过程。更具体地说,他们观察到当RNA聚合酶II(RNAP2)转录酶在其氨基酸尾部磷酸化或被磷酸基团修饰时,转录周期的开始。

“这里的跨学科科学是新的实验能力和单细胞动力学的机械计算建模的新方法的奇妙结合,两者在各自的领域都是非常新颖的,”Munsky说,他负责监督合作的计算方面。

在实验室里,研究人员将他们的抗体片段加载到一个已建立的哺乳动物细胞系中,该细胞系含有一个报告基因,当该基因被转录时,会被一个荧光标记的蛋白质点亮。Stasevich在几年前帮助开发的抗体片段,用荧光分子标记,照亮RNAP2尾部的特定靶点。将这些标记技术结合起来,研究人员可以区分转录周期中的三个不同步骤,并用不同的颜色标记。用该系统获得的图像转化为荧光强度波动。然后,研究人员利用这些信号来解释RNAP2磷酸化在整个转录周期中在单个拷贝基因上的时空组织。

通过计算模型获得新信息

蒙斯基的研究小组由研究生威廉·雷蒙德领导,他们采集了Forero和Stasevich的显微镜数据,并将其转化为基于随机微分方程的计算模型。通过拟合这个统计模型来重现所有的实验结果,计算团队随后扩展了他们的分析,以收集有关不同分子及其转录过程状态的新的机械和定量信息。

例如,他们估计了有多少单个RNA聚合酶分子聚集在DNA启动子区域形成短暂的簇,这些簇持续多久,以及聚合酶如何、何时、何地沿着DNA分布。例如,他们发现,每一次转录活动都会在基因的启动子区域产生一个由5到40个RNA聚合酶组成的簇,其中46%最终成功地转录了RNA。他们还发现,每一个RNA在释放前大约需要5分钟才能被完全转录和处理。

福雷罗说,这项技术具有深远的潜力,特别是与CRISPR等新技术相结合,在这种技术中,特定的基因可以被挑选出来并加以操纵。选择一个感兴趣的基因,比如说一个与疾病有关的基因,并应用CSU研究人员对转录周期的实时读数,可以让研究人员在单个基因的活动水平上观察疾病过程。

“在一个基因中解析转录周期的时空动态是这项工作最令人兴奋的方面,”Forero说。

参考文献:Forero-Quintero LS,Raymond W,Handa T,et al.活细胞成像揭示单个基因内源性RNA聚合酶II磷酸化的时空组织。Nat通信。2021;12(1):3158.内政部:10.1038/s41467-021-23417-0。

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